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浅谈影响荧光定量PCR实验结果的几大因素

更新时间:2023-11-28      浏览次数:1374

浅谈影响荧光定量PCR实验结果的几大因素


 

首先什么是PCR呢?

PCR的全称是聚合酶链式反应(英文全称:Polymerase Chain Reaction),是一种体外酶促合成特异DN的方法,也可以称作无细胞分子克隆或DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。它不仅可用于基因分离,克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方。


PCR分为定性PCR和定量PCR两类:定性PCR只能通过终点法对扩增产物进行定性分析,而不能进行定量分析;定量PCR能通过加入的荧光分子信号的变化来实现对PCR产物的实时检测。相对来说,定量PCR的检测灵敏度更高;特异性好,准确性高;线性关系好,范围宽;操作更简单安全。

 

PCR实验的基本因素及过程反应成分:引物,酶,模板DNA,dNTP,Mg2+镁离子浓度 。


反应过程:1、模板变性;2、引物退火;3、新链延伸。

这三个步骤为一个循环,每一个循环度产物均可作为下一个循环度模板,经过n次循环后,目的DNA以2n的形式增加。

 

除了以上五个主要因素外,还有实验耗材因素和温度因素:

1:首先PCR实验试剂的总体积一般为25ul~100ul,因此所选用的耗材必须是吸附低的;

2:PCR实验需要高温解链,低温合链,中温延伸,因此要求所选用的耗材需要有很好的热传导率;

3:PCR实验需要不断的循环升温,降温,这就要求所选用的耗材必须有良好的气密性;

4:PCR实验还需要循坏的收集数据,需要选用的耗材有良好的均一性。

5:另外根据实验使用仪器的不同,荧光定量实验中荧光读取方式不同,对耗材还有以下不同的要求:

  a:采用顶部荧光照射并于顶部回收荧光的仪器,要求管盖或者封板膜必须是光学透光的性能,同时管壁最好选择不透光材质;

  b:采用侧方荧光照射并于顶部回收荧光的仪器,要求管盖或者封板膜必须是光学透光性,同时管壁也要是高透光的透明材质;

  c:采用侧方荧光照射并于侧方回收荧光的仪器,要求管盖或者封板膜最好选用不透光材质,同时管壁选择高透光的透明材质。

 

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